本发明涉及一种牡丹花托愈伤组织诱导及分化不定芽方法。该方法包括如下步骤：选取花托外植体并进行预处理及常规消毒；将无菌花托在启动培养基上进行诱导培养，首先暗培养一周，然后转至弱光下培养30～50d，产生初始愈伤组织；将初始愈伤组织，转接到增殖培养基中进行增殖培养；将初始或增殖愈伤组织，转接到不定芽培养基进行不定芽分化培养，首先弱光培养4天，然后转至正常环境中培养，分化出不定芽。采用本发明所述方法，可快速获得大量花托愈伤组织及不定芽，诱导率分别达100％和91％，从而攻克了牡丹愈伤组织诱导率低、诱导质量差、不定芽分化困难这一技术难题，为牡丹品种改良和生物技术育种奠定了良好的基础。