本发明公开了一种仿生多孔组织工程软骨支架制备方法，将脱细胞处理的沃顿胶悬液与硫酸软骨素混合，沃顿胶悬液与硫酸软骨素混合比例为2.0：0.25～2.0：2.0，再次加入乙基二甲基胺丙基碳化二甲胺充分混匀后，室温下置于距光源5～10cm处在258nm波长紫外光照射下交联；将交联后的支架先后置于低温冰箱使支架定型，真空冷冻干燥获得成型支架，密封袋内贮存密封，60℃辐照消毒，4℃保存备用。本发明所制备的软骨支架具有仿生及多孔隙特点，可在体外诱导干细胞向软骨细胞分化，促进软骨基质成分蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达，可用于体外构建组织工程化关节软骨，为修复关节软骨缺损提供高品质支架材料。