本发明公开了一种骨缺损再生修复组织工程骨及其构建方法与应用，组织工程骨由三层骨髓间充质干细胞聚合体与两层骨基质颗粒构成的复合层状结构体；复合层状结构体是由骨髓间充质干细胞聚合体-骨基质颗粒-骨髓间充质干细胞聚合体-骨基质颗粒-骨髓间充质干细胞聚合体组成的复合体；骨髓间充质干细胞聚合体包括骨髓间充质干细胞以及由骨髓间充质干细胞分泌的并分布在骨髓间充质干细胞周围的胞外基质。采用本发明构建方法形成的组织工程骨同时复合活细胞及活性因子，修复重建过程快速，新生骨与周边自体骨结合完整、厚度一致，适用于骨缺损再生修复，实现了骨的生理再生并提高了骨缺损的修复治疗效果。