本发明涉及一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法，包括以下步骤：提供人类羊膜组织、用PBS缓冲液冲洗然后剪碎、加入质量浓度为0.1～0.3％的胰蛋白酶进行消化、加入I型胶原酶及高糖DMEM基本培养基至I型胶原酶终浓度为0.1～0.2％消化、离心分离，取沉淀物、沉淀物用PBS溶液重悬，过滤后离心分离，弃去上清液，获得人羊膜间充质干细胞。与现有技术相比，本发明利用少量胰蛋白酶预处理羊膜组织，使羊膜组织疏松，进而利用组织特异性更好的I型胶原酶处理羊膜，大大缩短了消化的时间，简化了原代分离的步骤，而且能够获得较高的干细胞产量，获得的干细胞活力也相比现有技术大大提高。