本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及一种角膜缘干细胞的分离方法。本发明将中性蛋白酶和IV胶原酶组合，使角膜缘组织在复合酶的共同作用下酶解，从而保证短时间内酶解获得细胞、减少对细胞的损伤，增大细胞得率，提高了所得细胞的纯度。该方法操作简便，不需要高端的仪器设备，对细胞的损伤也较小。实验表明，采用本发明提供的培养基分离角膜缘干细胞，每1cm³角膜缘组织能够获得8.4×10⁵个～9.0×10⁵个角膜缘干细胞，细胞中抗体CX43的阳性率为0，AE5的阳性率为0.1％，BrdU的阳性率为70.1％，PCNA的阳性率为82.1％。该效果显著优于现有技术。