本发明涉及生物技术领域，具体涉及多能干细胞的传代方法及其用途。该方法包括：将定量的多能干细胞小球移入培养基中，并混合均匀；利用移液器吸取混于培养基的所述多能干细胞小球，并利用所述移液器产生的压力挤压，使其通过30-70μm细胞筛的筛网，形成混于培养基的更多的多能干细胞小团块；将所述混于培养基的多能干细胞小团块移入新的培养皿中，完成传代。该方法用于脊椎动物门的胚胎干细胞和诱导多能性干细胞的传代。本发明适于悬浮培养形成的多能干细胞小球，是一种无需酶消化的新型传代方法。利用该方法传代后多能干细胞克隆球存活率高，可以达到90％，每次传代比率可达1:8至1:10，可以满足干细胞大规模量产化的需求。