本发明提供一种人鼻咽癌肿瘤干细胞系的建立方法，包括：（1）获得单细胞状态的人鼻咽癌细胞；（2）将步骤（1）得到的单细胞状态的人鼻咽癌细胞加入含表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的无血清干细胞培养基中，得单细胞悬液；（3）将步骤（2）中的单细胞悬液浓度调整至900～1100个单细胞/ml；（4）将步骤（3）得到的单细胞悬液1ml接种于细胞培养板六孔板单孔中，再加入等体积干细胞培养基进行培养72～96h；（5）收集步骤（4）所得细胞，胰酶消化至单个细胞并进行传代培养。本发明提供的鼻咽癌干细胞系建立方法，操作简便，得到的鼻咽干癌细胞系的干细胞特征明显。