本发明的大鼠CYP450酶亚型质谱绝对定量方法，属于蛋白质组学技术领域。本发明基于LC/MS/MS技术，利用CYP450酶经胰酶水解产生的特异性肽段对酶进行定量的策略，实现了同时对大鼠肝微粒体等体系中5种CYP450酶亚型CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、CYP2B2的绝对定量。本发明主要包括如下步骤：蛋白样品的预处理、标准曲线的制备、质控样品的制备以及蛋白样品的测定。本发明的方法线性关系良好、准确度高、重现性好而且灵敏、精密、可靠，可用于新药开发、药物代谢研究及药物相互作用的评价。