本发明提供了一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法，属于微生物发酵制药领域。采用的技术方案为：纤维堆囊菌菌株由摇瓶培养后逐级放大，发酵纤维堆囊菌，再经大孔树脂吸附、乙酸乙酯解析、甲醇复溶，得粗品；粗品经柱层析、HPLC分析得到埃博霉素B的初步组分，再加入分子印迹聚合物特异性吸附埃博霉素B，最后经甲醇洗脱、结晶，得到埃博霉素B。本发明通过逐级发酵生产纤维堆囊菌，同时在分离提取过程中采用具备特异性靶向吸附能力的分子印迹聚合物，不仅对埃博霉素B具有很强的吸附力，而且可以很容易地将埃博霉素B萃取出来，从而降低了分离提取埃博霉素药物的生产成本，具有更广阔的工业化应用前景和经济效益。