本发明涉及一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法与应用，该方法利用在Loxl3基因关键外显子两端添加Cre重组酶靶向序列loxP位点，构建条件性基因敲除载体，转染胚胎干细胞(ES细胞)，再进行显微注射制作可用于条件型基因敲除的floxed小鼠，再与相应组织特异性的Cre小鼠交配，可获得能在特定组织敲除Loxl3基因的小鼠。该方法制得小鼠作为腭裂疾病发病研究的模型鼠，有利于详细阐明Loxl3基因在组织中的功能以及对胚胎发育调控的机理中的作用。同时该小鼠还可以作为研究Loxl3基因功能的动物模型，具有重要的应用价值。