本发明提供一种肝癌干细胞的无血清培养基及其培养方法，以DMEM／F12+GlutaMAXTM^-1培养基为基础，包括：人重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10、胰岛素一号增长因子、无血清补充营养成分、肝素、青霉素+链霉素双抗溶液。本发明带来了以下效果：1.本发明中的无血清培养基添加了三个特殊的生长因子并按相应比例配置；直接无血清培养，使肝癌细胞可以成球且成球率高，并可以连续稳定传代；2.本发明中生长因子可维持一小群细胞处于未分化状态；在肝癌干细胞无血清培养的基础研究及临床应用上将具有广泛的前景；为肝癌干细胞的研究提供了丰富的实验材料。