本发明提供了一种用于体外培养小肠干细胞的培养基，包含基础培养液；转铁蛋白；乙醇胺；抗坏血酸、或其盐、或其酯；谷胱甘肽或其盐；及亚硒酸钠，其中，乙醇胺于该培养基中的浓度范围为0.5mM至小于5mM。本发明进一步提供一种体外培养小肠干细胞的方法，该方法包含将所分离的小肠干细胞于本发明的培养基中培养。本发明提供的培养基可提供小肠干细胞更佳的生长环境，并维持其未分化的细胞型态及干性胞特性，且不含血清，对于临床上的应用更具潜力。