本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及羊水间充质干细胞的原代分离培养方法。本发明提供的方法，利用差速贴壁原理，在适宜条件下，使内皮细胞先贴壁生长，而此时间充质干细胞尚未贴壁。本发明准确控制培养时间，待内皮细胞贴壁完成后，转移包含羊水间充质干细胞的培养液。对培养液进行传代培养后获得羊水间充质干细胞。本发明提供的方法操作简单，无需更多的仪器，且无需人为刮除的操作，避免了细胞的损伤和污染。检测结果表明，步骤1中获得的培养液中所包含的羊水间充质干细胞的活力不低于89.28％，经传代3代，流式细胞检测结果表明，其表面抗体仍符合干细胞特性，未见分化趋势。