本发明涉及生物技术领域，公开了一种胎盘造血干细胞的制备方法。该方法用灌洗液灌注清洗预处理后的胎盘；将酶解液从胎盘动脉灌注至胎盘静脉流出酶解液停止并结扎胎盘动静脉静置；松开胎盘动静脉并从动脉灌注灌洗液，从静脉处收集全部液体，离心取细胞沉淀，然后依次经羟乙基淀粉法和红细胞裂解法回收纯化包含造血干细胞的单个核细胞，重悬后获得所述胎盘造血干细胞。本发明改善酶解灌注法工艺，选择多种相互适宜的组分组成新型酶解液应用于胎盘造血干细胞制备过程中，不仅能够动员胎盘内部的造血干细胞并在短时间内迅速进入血液循环系统，而且同时提高了包含造血干细胞的单个核细胞数量及其活细胞数量以及CD34阳性细胞数量。