本发明将构建好的重组质粒pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21通过脂质体转染B16F10细胞，并通过G418筛选稳定转染的细胞株。将单克隆扩大培养的B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21细胞，利用免疫磁珠分选技术分离出B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21CD133⁺CD44⁺肿瘤干细胞，经丝裂霉素灭活，即为B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21肿瘤干细胞疫苗。