本发明公开了一种化合物Aspochalasin？V及其制备方法和应用，所述化合物Aspochalasin？V的结构如式（Ⅰ）所示，所述制备方法，包括：将黄柄曲霉CCTCC2013631接入培养基中进行发酵培养；发酵培养后，分离得到发酵液，用有机溶剂对发酵液进行萃取，得到萃取液；将所述的萃取液浓缩后依次经正相硅胶色谱柱和高效液相色谱分离纯化，获得所述的化合物Aspochalasin？V。本发明还公开了所述化合物Aspochalasin？V在制备抗肿瘤药物或肿瘤预防保健食品中的应用。本发明的化合物Aspochalasin？V具有抗肿瘤活性，且制备方法简便，易于操作，生产成本低廉，适合规模化生产。