本发明公开一种双层修饰纳米四氧化三铁磁流体的制备方法，该方法以可溶性铁盐、可溶性亚铁盐和硬脂酸为原料，通入氮气进行气氛保护与搅拌，在水浴条件下制备出单层修饰的纳米四氧化三铁；然后以山梨醇或十六烷基三甲基溴化铵等为原料，在超声处理条件下，制得双层修饰的纳米四氧化三铁磁流体；本发明工艺简单，便于操作，所得产品可控性强，具有超顺磁性，可用于磁热疗，磁分离，靶向药物治疗以及生物工程材料等领域。