本发明公开了一种复制子DNA疫苗载体及其构建方法与其在制备复制子DNA疫苗中的应用。本发明具有卡纳霉素抗性的复制子DNA疫苗载体，是将复制子DNA疫苗载体pSCA1中的氨苄青霉素抗性基因置换为卡那霉素抗性基因后得到的，从而使得用该载体制备的复制子DNA疫苗能够适应临床上对氨苄青霉素类药物的实际需求，提高临床应用的安全性。