本发明公开了一种抗CD20抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用。所述抗CD20抗体-海兔毒素偶联物由海兔毒素通过连接臂偶联抗CD20抗体构成。其中，抗CD20抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述应用为抗CD20抗体-海兔毒素偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明偶联物具有抗CD20抗体和MMAE两者的生物学功能，在二者的协同下，抗肿瘤效果得到显著增强。