本发明属于明胶球制备技术领域，特别是涉及一种纳米级、形态规则、尺寸均一、分散度好的明胶纳米球的制备方法。该方法克服了现有技术的不足，是通过调整溶液pH值、明胶溶液反向滴加、低温超声乳化等方法，控制明胶球的尺寸，减少明胶球之间的粘连和融合，使制备出的明胶纳米球球形良好，球与球之间更趋分散。该方法操作简单，所制备的明胶纳米球为微黄色粉末，直径在50～350nm范围内。作为药物载体，该方法制备出的明胶纳米球可更稳定的缓释药物。作为基因载体，该方法制备出的明胶纳米球更有利于细胞吞噬和向细胞内转染基因。