本发明的目的是提供一种基于青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法快速检测试剂盒的制备方法，及其使用检测方法，以解决传统ELISA方法检测β-内酰胺类药物时漏筛的问题。本发明公布了一种青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法检测试剂盒制备方法，以及一种采用青霉素结合蛋白PBP6的β-内酰胺类抗生素受体法检测试剂盒对牛奶中β-内酰胺类药的含量的间接竞争受体法检测方法，本发明的有益效果是利用了青霉素结合蛋白6能与β-内酰胺类药物特异性结合的特点，能在缓冲液体系或者样本基质提取液中特异性地识别该类药物，不受到其它抗生素类如大环内酯类、喹诺酮类、四环素类的影响。