本发明公开了一种人口腔鳞癌CAL-27耐药细胞株的培养方法及所得的细胞株。该方法包括：（1）在细胞培养皿中种植CAL-27亲本细胞，细胞长至贴壁后待融合率达到30～40%时加入筛选药物，初始浓度采用该药物的IC₂₀值，连续作用24～72小时后洗去死细胞并扩增存活的细胞；（2）待细胞重新处于对数生长期时，重复（1）中所述洗去死细胞并扩增存活的细胞的操作，并将筛选药物的浓度提高一倍作用，在筛选药物的浓度提高至第一定值时，降低药物浓度增加倍数，在筛选药物的浓度加至第二定值时，将细胞经过冻存后复苏细胞，即得。所述的耐药细胞株具有临床上的人口腔鳞癌的生物学性状，是研究人口腔鳞癌细胞的耐药机制的理想模型。