本发明公开了一种上转换发光纳米探针的制备方法，包括将掺有Yb和Er的NaYF₄、NaGdF₄或CaF₂的一种上转换发光纳米颗粒用赖氨酸、聚乙烯亚胺或聚丙烯酰胺进行氨基化表面修饰，再用胭脂红酸的羧基进行酰胺化表面耦联。用本发明制备而成的探针可用于测定药物抗氧化活性，通过测定待测药物与羟基自由基的混合液在加入上转换发光纳米探针水溶液前后的发光强度变化来测定药物的抗氧化活性高低。本发明测定方法具有操作简单方便，灵敏，快速有效，抗自发信号干扰的优点，克服了现有方法存在的技术问题，为药物评价提供了一种全新的检测方法，可用于快速筛选抗氧化活性高的药物，以及快速比较不同药物之间的抗氧化活性高低，从而为抗氧化性药物研发提供了有效的技术支持。