本发明公开了一种三叶青种质资源的离体的保存和保存后的恢复方法，它是以三叶青带腋芽的茎尖为外植体，用8%次氯酸钠表面消毒8min，无菌水冲洗2次，再用0.1%升汞灭菌5min，无菌水冲洗8次后，将其切割成1cm左右的茎段接入培养基1中；20天后将萌发的腋芽转接到培养基2中进行扩繁；再30天后将增殖的不定芽转入培养基3中诱导生根；再20天后将形成的试管苗转入培养基4中于8±1℃和光照600Lux条件下进行保存。本发明提供的三叶青种质资源的离体的保存和保存后的恢复方法，应用该项技术保存种质时间长、种质质量稳定，且种质保存工艺简便，技术稳定可靠，可重复性强，适合大规模三叶青种质资源的保存。