本发明提供一种车前草离体快速繁殖的方法，包括如下步骤：1）愈伤组织诱导培养：将经灭菌消毒的车前草叶片切去叶脉和叶缘，切成小块，接种到愈伤组织诱导培养基上，常规培养至形成愈伤组织和不定芽；2）生根培养：挑选步骤1）中芽长达2-3厘米的不定芽，将其从愈伤组织上切下，其余愈伤组织和不定芽继续愈伤组织诱导培养，切下的不定芽接种到生根培养基上，常规培养至长出白色的根，获得无菌车前草种苗。本发明的方法外植体消毒效率高达80%，无菌苗生根率达100%，可快速繁殖车前草无菌种苗，解决了车前草植株的繁殖能力低、繁殖周期长、资源匮乏、农药残留等诸多问题，在保护野生车前草自然资源和良好的生态环境等方面具有重要意义。