本发明涉及一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法。其步骤如下：（1）将烤烟型烟草品种的种子播于苗盘中，待种子萌发得处理后茎尖作为外植体备用。（2）茎尖接种至附加吲哚乙酸0.02～0.05mg·L^-1和赤霉素1.50～1.70mg·L^-1，食用白糖10g·L^-1，琼脂条8.5g·L^-1的基本培养基中进行脱除烟草花叶病毒培养；（3）培养温度控制在52～54℃，培养48～54d后，实现烟草花叶病毒脱除。（4）当茎尖生长至1.0cm时，即可切割0.05cm的茎尖进一步开展无毒苗培养，可直接应用于无花叶病毒烟草种苗的工厂化生产。腋芽萌发生长及茎段基部生根培养，成苗率可达99.3%。无毒苗成活率达95.0%以上。