一种药用盾叶薯蓣组培苗无菌短枝生根的方法，步骤包括：选用盾叶薯蓣经组织培养获得的无菌短枝为外植体；将无菌短枝接种在1/2MS大量+10×MS微量+MS有机+DL铁盐+CCC 0.1～2.0mg/L+PP₃₃₃0.1～2.0mg/L+IAA0.01～0.1mg/L+IBA0.01～0.2mg/L，以及添加有蔗糖和琼脂的培养基中培养25-40d后形成大量不定根；蔗糖添加量3％，琼脂添加量0.75％；最后是移栽和大田进行种茎繁育。本发明不仅简化了健康种苗生产程序，而且生产成本低，还解决了无菌短枝很难生根的问题，提高了生产效率。