本发明公开了一种巨桉组培苗的培育方法，包括以巨桉组培苗叶片为外植体，对巨桉叶片进行愈伤组织诱导，对叶片愈伤组织进行不定芽分化培养以及进行生根培养的操作步骤，其特征在于在红光和蓝光照射条件下对巨桉叶片进行愈伤组织诱导；在红光或蓝光照射条件下对叶片愈伤组织进行不定芽分化培养；在绿光照射条件进行不定芽生长培养，再转移到LED黄光下进行生根培养。本发明根据巨桉叶片在不同组培阶段对光的需求差异及时调整光源，有效提高了愈伤组织诱导率、不定芽分化率及生根率。此外，本发明耗能低，且与传统组培法相比能大幅度提高巨桉组培苗的产量并有效缩短出苗时间。