本发明公开了一种皇帝蕉的离体再生和遗传转化的方法及其离体再生培养基。本发明以皇帝蕉雄花薄片为外植体，采用离体再生培养基诱导获得不定芽，将不定芽的切片作为转化受体，通过基因枪和农杆菌介导法相结合的方法将T-DNA插入到皇帝蕉基因组中，得到转基因皇帝蕉。通过试验证明：与单独基因枪法转化和单独农杆菌介导法相比，本发明的方法转化效率高且转化周期短。本发明建立了适合皇帝蕉的高效遗传转化体系，为通过生物技术手段培育皇帝蕉新品种奠定了基础，更为今后皇帝蕉乃至其它香蕉基因功能的鉴定及转基因新品种的培育提供技术支撑。