本发明公开了一种生产低糖高烟碱烟叶的烤烟种质培育方法，包括下列步骤：（1）人工合成烟草钾离子转运体HAK1基因序列；（2）构建CaMV 35S驱动HAK1的植物表达载体pBI-HAK1；（3）转化土壤农杆菌和烟草外植体；（4）转基因株系的分化、移栽。本发明既降低了烤后烟叶的糖含量，同时也增加了烟碱含量，有利于生产低糖高烟碱的烟叶原料。