本发明涉及一种分离与培养红豆杉干细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤；(1)将红豆杉嫩枝经消毒后切割得到外植体切片；(2)外植体切片在1.0-10.0mg.L^-1的柠檬酸溶液中浸泡0.5-2.0分钟，后放置在含有0.5-4.0mg.L-1的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5-4.0mg.L-1萘乙酸和0.5％-5％椰乳的B5培养基上；(3)将增殖的外植体取出，分离干细胞并转移到转继代培养基上培养；(4)继代培养基为B5培养基，另添加0.5-4.0mg.L^-1的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5-4.0mg.L^-1萘乙酸、10-200毫克/升的腐殖酸钠、0.5-4.0毫克/升的硝酸银和75-200毫克/升的二硫苏糖醇，每两周继代一次。该方法通过分离及培养干细胞来获取紫杉醇，干细胞是处于未分化状态的细胞，具有无限分裂的能力，所以后期培养中如果采用干细胞将可以避免愈伤细胞的缺点。