本发明提供了一种北美冬青的组织培养方法，包括以下步骤：1）从雌株选取外植体：2）外植体处理，包括消毒：3）芽诱导培养：4）芽增殖培养：5）根诱导培养。该组织培养方法成活率高、繁殖速度快，增殖系数达到6.1，生根率达到95.2%，得到品质纯正的北美冬青雌株苗，本发明的方法不受季节限制，可常年、快速繁殖北美冬青，实现北美冬青的规模化生产，为北美冬青快速推广提供可行的方法。