本发明公开了一种马尾松优良单株无菌外植体制备及初始芽诱导方法，选用成年优株当年新抽嫩稍的萌芽条为接穗，以马尾松组培苗为砧木进行嫁接，萌芽条采用系列消毒剂配合消毒的方式进行消毒处理，将外植体接穗置于经优化的诱导培养基中进行初始芽诱导，获得无菌外植体及生长快、活力旺盛的马尾松初始芽。本发明解决了马尾松成年优株组织培养中外植体消毒困难、褐化、初始芽发生率低、芽苗活性差等的技术问题，提高了初始芽发生率和芽苗活性，可获得90%以上无菌的健壮外植体，具有较好的经济效益和社会效益。