本发明提供一种免疫增强剂、灭活疫苗及其制备方法,涉及生物制药领域。免疫增强剂含有0.1-21mg/mL的单磷酰脂质A、1.5-125mg/mL的胞壁酰二肽和0.7-4.5mg/mL的β-葡聚糖。一种含有所述免疫增强剂的灭活疫苗。一种所述灭活疫苗的制备方法，将免疫增强剂与灭活的抗原溶液混合，得到水相溶液；将水相溶液与油相溶液混合，得到灭活疫苗。本发明免疫增强剂由于其组分之间的协同效应，提高机体的免疫水平、对抗原的免疫应答，从而提高免疫后的抗体水平、缩短免疫窗口期，增强疫苗的免疫效果。本发明含有免疫增强剂的灭活疫苗，免疫后产生的抗体水平高，保护期长，免疫窗口期短。