本发明涉及生物制药技术中糜蛋白酶领域一种糜蛋白酶的纯化工艺：碎浆；盐析，过滤；加入硫酸铵至0.4饱和度，冷室中放置过夜；过滤，用50kDa的超滤膜进行超滤；用5-10kDa的超滤膜进行超滤；滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜；过滤，析晶；活化；沉淀；用10kDa的超滤膜进行超滤；SP离子交换柱纯化；用10-30kDa的超滤膜进行超滤，除菌，既得。使用超滤膜与离子交换柱的结合来纯化糜蛋白酶，纯化效果好，得到的产品纯度高；本发明工艺得到的糜蛋白酶酶活性高，大于1500U/mg，可以减少用药量，减少患者医疗支出，也提高了该酶的用药安全性。