本发明涉及一种微米级单分散聚脲微球的制备方法，该方法是：在室温下将水和丙酮混合溶剂及二异氰酸酯类化合物单体加入到反应瓶中，其中，水/丙酮的质量比为2/8~6/4，二异氰酸酯类化合物单体占混合体系总质量的0.5~10.0%，密封摇匀，置于恒温水浴振荡器中，在振荡频率为70~150次/分钟、温度为20~80℃条件下进行聚合反应；聚合完成后产物经过离心分离及干燥即得微米级单分散聚脲微球。本发明仅使用一种单体，在振荡条件下进行沉淀聚合，过程简单、原料单一、反应耗时短、单体可完全转化，微球收率可达86%以上。所得微球表面洁净且含有大量胺基，可用于蛋白质的吸附与分离、酶固定和色谱分析等领域。