本发明涉及一种应用液质-质联用仪测定淡水池塘底泥中氯霉素的方法，包括步骤有：(1)养殖池塘底泥样品采集；(2)样品的提取；(3)正己烷净化；(4)水饱和乙酸乙酯溶液提取；(5)氮气吹干提取液，乙腈－水(5+95)溶解得备用液；(6)固相萃取柱洗脱；(7)水饱和乙酸乙酯溶液提取，氮气吹干；(8)甲醇水(50+50)溶液溶解，涡旋后经0.22μm微孔滤膜过滤后用液质-质联用仪上机测定。本发明方法通过对淡水池塘底泥进行前处理，去除基体干扰物，提高了灵敏度，优化了前处理过程，并且样品无需衍生化，简化了操作步骤，可为污染来源排查及评价生态环境对健康养殖的影响提供可靠的检测手段。