本发明涉及一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，包括：渗透性冷冻保护剂5~10%、非渗透性冷冻保护剂1~5%、血清替代品10~20%和无血清基础培养基70~80%。本发明还公开了该冻存保护液的制备方法，具体为：1）将无血清基础培养基、非渗透性冷冻保护剂和血清替代品预冷，混合、摇匀；2）加入渗透性冷冻保护剂；3）在2~6℃温度条件下冷藏30min以上即可。本发明还公开了采用上述冻存保护液对人脐带华通氏胶组织的冻存方法，包括如下步骤：1）脐带预处理；2）剥取华通氏胶组织；3）人脐带华通氏胶组织冻存。本发明的冻存保护液和冻存方法处理人脐带华通氏胶组织，具有减少脐带间充质干细胞在冻存过程中的损伤，保证脐带间充质干细胞的活性和临床使用安全性的优点。