本发明公开了一种无血清低温保护剂，包含细胞内渗透保护剂和细胞外保护剂，所述细胞外保护剂由NaCL、KCL、Na₂HPO₄.12H₂O、KH₂PO₄、PEG(400-2000)、D-海藻糖和胶原IV组成，所述细胞内渗透保护剂为DMSO。本发明还公开了一种制备无血清低温保护剂的方法。本发明不含有任何来源的血清成分，在低温储存细胞时不会有血清成分残留，本发明成分明确、简单，易于配制，可用于间充质干细胞的低温储存。