本发明涉及干细胞领域，公开了一种皮肤纤维母细胞的培养方法。本发明所述皮肤纤维母细胞的培养方法，皮肤预处理后加入胰蛋白酶，4℃消化后去除表皮，剪碎后置于离心管中加入含双抗的PBS，离心弃掉漂浮的组织块及上清，用完全培养基重悬沉淀的组织块，添加双抗，37℃、5％CO2培养箱中进行培养，随后进行换液和传代处理直至第10代。本发明所述培养方法操作简单、安全有效。实验表明，与现有方法相比，本发明所述皮肤纤维母细胞的培养方法能够缩短细胞爬片时间，而且能够获得更多的细胞量且能很好保持皮肤纤维母细胞的形态和良好的细胞特性，适用于皮肤纤维母细胞的大量培养。