本发明公开了一种基于TMRM的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值检测方法，本发明首先对传统的基于TMRM的细胞静息膜电位检测方法进行了改进，以C17.2神经干细胞为模型，用双结合位点的方法较为准确的标定了细胞核区的TMRM非特异性吸附，提高了计算细胞静息膜电位时的精度，并在该方法基础上，通过钠离子荧光染料CoroNa Green对胞内钠离子浓度进行检测，进一步计算了钠钾离子通透性比值，从而建立了一种具有较高精度的非侵入性的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值检测方法，该方法法能够对平面细胞和三维生长的细胞进行较为准确的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值检测。