本发明公开了分离富集外周血中CD34⁺和CD90⁺干细胞的方法，更好地为CD34⁺和CD90⁺干细胞进行后续研究提供基础，涉及生物医学领域。方法包括多臂井星聚合物与鼠抗人CD34⁺或CD90⁺单克隆抗体共价偶联、鼠抗人CD34⁺或CD90⁺单克隆抗体修饰的多臂井星聚合物再包被长链生物素分子、鼠抗人CD34⁺或CD90⁺单克隆抗体和长链生物素共修饰的多臂井星聚合物捕获外周血样品中的CD34⁺和CD90⁺干细胞、链霉亲和素修饰的纳米磁珠识别并偶联外周血中长链生物素化多臂井星聚合物、被捕获CD34⁺和CD90⁺干细胞的分离及重悬等步骤。重悬液可以直接进行后续分析，与传统的细胞分离方法相比，该方法更适用于在复杂外周血样品中对CD34⁺和CD90⁺干细胞进行磁分离，提高了外周血样品中CD34⁺和CD90⁺干细胞分离效率。