本发明公开一种抗癌症干细胞特异性蛋白CD44的单链抗体及其应用。该单链抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQID NO.2所示的轻链可变区。本发明通过酵母双杂交的方法在人类单链抗体文库中筛选与人类CD44S胞外段相互作用的单链抗体，由于酵母是真核生物，使得CD44的结构更接近在哺乳动物细胞里的结构，再加上高表达的载体以及CD44序列的酵母表达优化，确保了融合蛋白的高表达，筛选所得的单链抗体的可靠性更好；本发明使用CD44S作为抗原筛选单链抗体，由于所有CD44V都包含CD44S的外显子部分，因此筛选所得的单链抗体很可能与所有CD44V都相互作用；本发明所提供的单链抗体是全人源段的，无免疫原性，可更好的使用于人类和开发抗癌药物。