本发明公开了一种可注射骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶及其制备方法和应用。本发明通过体外单层高密度培养兔的骨髓间充质干细胞，收集其分泌的细胞外基质，利用冷冻干燥、液氮下研磨及酶促消化技术获得均匀的细胞外基质混悬液。接着将细胞外基质混悬液与琼脂糖等体积充分混匀，制备成骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶材料。该材料通过简单的注射方式即可注入任意形状的软骨缺损部位，并且与周边宿主组织有较佳的附着整合能力。本发明可注射自体骨髓间充质干细胞外基质/琼脂糖复合水凝胶，其细胞来源充足，避免了异体来源材料存在的潜在风险，并且便于修复任意形状的软骨缺损，达到与周边宿主组织更好的整合。