本发明公开了一种分离提取大鼠大网膜脂肪间充质干细胞的方法和专用培养基。无菌条件下取健康斯泼累格·多雷（Sprague Dawley，SD）大鼠的大网膜脂肪，剪碎后用冰磷酸盐缓冲液混合后离心，去除部分脂肪组织。用I型和II混合胶原酶消化离心，去除上部脂肪细胞组织。再次离心后用加入含有特定化学物质和生长因子的专用培养基重悬后移入培养瓶中放入培养箱中持续传代培养。本发明在大鼠体内提出一种大网膜脂肪来源的间充质干细胞，同时在培养过程中通过添加特定的化学物质和生长因子的专用培养既可以解决干细胞在体外培养中容易衰老以及分化问题，获得了一种能长期保持干细胞特性的大网膜脂肪来源的间充质干细胞。