本发明公开了一种牙齿来源间充质干细胞体外分离与培养方法，包括步骤：A）将牙齿表面的牙龈和周围的组织刮去，将其保存在牙齿保存液中；B）在离心管加入培养液，将牙髓收集到离心管中，再用剪刀剪碎；C）加入Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶消化牙髓组织；D）单细胞悬液的制备；E）对获得的单细胞进行原代培养，原代细胞种植密度1-5×10⁴/cm²；F）细胞传代培养。本发明使用物理方法破碎牙齿获取牙髓组织，利用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶进行消化，获取单细胞悬液，进行原代种植培养10-15天，进而进行细胞传代；有效的解决了原代细胞混杂牙齿其它组分，并且细胞团块培养过程中易发生老化的问题。