本发明公开了一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法，包括步骤：A）样本采集和细胞分离培养；B）传代培养：原代细胞经过培养，待细胞融合度达到80%以上，继续传代培养；C）生长曲线绘制；D）细胞检测：采用第三代细胞进行检测，准备消化好的第三代脐带间充质干细胞，缓冲液洗涤后对细胞进行抗体标记经孵育洗涤后，进行检测。本发明同时使用两种类型的胶原蛋白酶，透明质酸酶结合中性蛋白酶或accutase对脐带组织进行消化可以使得组织块快速充分的消化。