本发明公开了一种晶状体上皮干细胞的分离培养方法，它包括以下步骤：(1)取晶状体前囊膜，剪成碎片，消化，将获得的细胞铺于包被有基质的培养瓶、培养板或培养皿中；(2)加入添加有含有15～25％FBS、50～150μg/L人表皮生长因子(FGF)、5-10mg/L胰岛素、5-10mg/L氢化可的松、5-10mg/L霍乱弧菌毒素、0.01-0.05mg/L3,3′,5-碘-L-对羟基苯丙氨酸、1-5mg/L腺嘌呤、5～10mg/L甘氨酸、6～12mg/L丙氨酸、10～16mg/L天冬酰胺、10～16mg/L天冬氨酸、12～18mg/L谷氨酸、8～15mg/L脯氨酸、7～14mg/L丝氨酸的MEM培养液，放入37℃孵箱中培养，2-3天形成克隆，10-14天可形成单层活性的晶体干细胞细胞。本发明还公开了一种晶状体上皮干细胞的分离培养液。本发明方法可以分离得到原代晶状体上皮干细胞，干细胞的活性高，本发明方法简便、易操作，应用前景良好。