本发明公开了一种双荧光报告系统在肿瘤干细胞靶向性药物筛选中的应用及方法。通过使用红色和绿色荧光蛋白对群体肿瘤细胞和肿瘤干细胞分别进行标记，利用高内涵成像系统即可评估药物分别对肿瘤细胞和肿瘤干细胞的靶向性。由于目前还没有很好的靶向肿瘤干细胞的药物筛选方法，本发明建立的肿瘤干细胞筛选方法可望用于针对肿瘤干细胞进行新型抗肿瘤药物的筛选，从而提高抗肿瘤药物的筛选效果。