本申请公开了一种干细胞冷冻保存箱及冷冻保存方法，该保存箱包括：箱体、箱盖和隔板，其中：箱体顶部设置开口，箱体上位置相对的两个侧壁的外侧均设置有压力调节固定装置；多个采集袋和多个隔板交替放置在箱体内，且位于最顶部为隔板；箱盖位于箱体顶部，且箱盖通过卡扣将箱盖与箱体侧壁上的压力调节固定装置相连接。与现有技术相比，本申请提供的该干细胞冷冻保存箱及冷冻保存方法在使用时，可以将同一患者的干细胞样本放置在一个箱体内，并且箱盖可以将采集袋压成扁平状，使干细胞可以均匀降温；每个箱体作为一个独立的存储单元，方便取用，并且在取用时操作简单、耗时较短，缩短了冰箱开门时间，对其他箱体的温度影响较小。